在miRNA的研究中，验证miRNA与基因靶向关系是一个常见的课题。miRNA通过其种子序列（即5’端第2-8个碱基）与mRNA的3’UTR区域结合，进而诱导细胞沉默复合体介导的mRNA降解或抑制mRNA的翻译过程。基于这一原理，研究者通常将靶基因的3'UTR（或结合位点下游500bp）插入荧光素酶报告基因载体luciferase的下游，并与miRNAmimics共同转染目标细胞，随后加入底物以检测荧光素酶活性的变化。如果荧光素酶活性发生下调，则表明该miRNA与靶基因的3'UTR区域存在相互作用。

常用的载体包括PGL3-CMV-LUC-MCS，利用双荧光素酶报告基因检测技术，可以有效验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用，其工作原理主要涉及以下几个步骤：

miRNA靶基因的生物信息学预测

利用生物信息学分析软件（如TargetScan、StarBase和miRanda等），分析特定靶基因的3'-UTR区序列是否包含miRNA结合位点。将能够与miRNA结合的靶基因3'-UTR序列插入载体中，与萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）相连。当miRNA与质粒中的插入序列结合后，miRNA将抑制萤火虫荧光素酶的翻译，最终导致荧光值的降低。

结构验证与结果分析

通过上述步骤，双荧光素酶报告基因检测可以有效验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用，从而为研究miRNA的功能及其调控网络提供重要工具。

AG百家乐双荧光素酶报告基因检测服务流程

在进行实验之前，需要进行充分的准备，材料包括HEK293细胞或指定的目标细胞，以及合适的转染试剂，如HieffTrans® Invitro siRNA/miRNA Transfection Reagent（货号：40806ES）。报告基因检测试剂盒为Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit（货号：11402ES）。此外，还需要一系列实验室仪器和耗材，如酶标仪和细胞培养板等。

若选择在目标细胞中进行验证实验，则需确认细胞的质粒瞬转效率，以及探索合适的瞬转体系。当质粒瞬转效率超过40%时，表明预实验通过。实验步骤包括：

1. 将状态良好、处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化，并用完全培养基悬浮成单细胞悬液，进行细胞计数后接种于24孔培养板中。
2. 培养过夜，观察细胞生长状态，在细胞覆盖率达到70%左右时进行转染实验。
3. 转染前用新鲜的培养基更换液体。
4. 按照转染试剂使用说明书进行操作。
5. 转染48小时后，收集细胞样品。

数据检测与分析

样品收集后，依据报告基因检测试剂盒的说明操作进行检测。首先对裂解产物进行离心处理，然后配置Renilla Luciferase Assay工作液，并根据仪器说明书进行荧光素酶测定。实验分组包括不同的mimics和质粒组合，以便于比较和分析实验结果。

AG百家乐致力于提供高质量的双荧光素酶报告基因检测服务，旨在加速基础研究及药物筛选进程，助力科研人员在miRNA功能及其调控网络的探索中取得更大的进展。

相关产品清单

以下是与双荧光素酶报告基因检测相关的产品：

• 双荧光素酶报告基因检测试剂： Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit（货号：11402ES）
• 辉光型双荧光素酶报告基因检测试剂盒： Dual One Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit（货号：11405ES）
• 转染试剂： HieffTrans® Liposomal Transfection Reagent（货号：40802ES）