通过体外转录获得的mRNA，其反应混合物不仅含有目标产品mRNA，还包括多种杂质，如T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、NTP、模板DNA、盐离子以及IVT过程中生成的mRNA副产物（如双链RNA和截断RNA片段）。这些杂质可能会对mRNA的功能产生负面影响，包括影响其定量精度、降低翻译效率或改变免疫原性。因此，需要采用纯化技术将目标mRNA从IVT混合物中分离出来，以确保其纯度和完整性，进而保证产品的安全性和有效性。

常见的mRNA纯化方法有氯化锂（LiCl）沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化和层析纯化等。其中，沉淀、磁珠和硅胶柱纯化等方法操作简单快捷，但通常适用于小体量样品，纯化效率有限。因此，这些方法主要应用于科研和早期研发场景，而在工业生产中，层析纯化则是最主要的选择。

硫酸铵沉淀法

在2024年1月，中国科学院过程工程研究所的张松平团队发表了一篇题为“Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature”的研究文章，探讨了硫酸铵沉淀法在纯化mRNA中的有效性。其研究对象为增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码的mRNA。结果显示，在硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%。当硫酸铵浓度进一步提高时，沉淀速率并未显著变化。此外，溶解率也是一个重要指标，研究表明，在高于18M的硫酸铵浓度下，沉淀物可迅速溶解于不含RNase的水中，溶解率达到90%以上。

硅胶柱膜纯化

硅胶柱膜纯化基于硅胶膜表面硅醇基团与mRNA分子之间的相互作用。硅胶膜表面呈弱酸性，并在高盐条件下能中和mRNA的电荷，实现有效结合。在低盐或水溶液状态下，硅胶膜则释放mRNA，从而有效分离杂质。该方法材料安全无毒，符合环保标准，有助于保护实验人员的健康。

磁珠法与层析法

在工业级纯化中，层析法被广泛应用以获取更高的核酸质量。mRNA纯化的主流方法为Oligo(dT)亲和色谱，但由于这一方法无法区分带有Poly(A)尾的ssRNA和dsRNA，通常与其他技术（如疏水层析、阴离子层析）联用，以提高纯化效果。通过调节盐离子浓度、pH、温度等条件，可以显著提高最终纯化效果，强调了精细化工艺开发的必要性。

蛋白酶K纯化

在工艺中，蛋白酶K作为高效的广谱丝氨酸蛋白酶，能够有效去除与核酸结合的蛋白质杂质。然而，蛋白酶K可能具有某些免疫原性，可能会影响mRNA疫苗的安全性和有效性。因此，在应用过程中，应优化蛋白酶K的添加量，以确保其有效性并不影响mRNA的完整度。

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