## 培养条件

**气相条件**：培养气相为95%空气和5%二氧化碳，温度设定为37℃，培养基选用DMEM，同时添加10% FBS和1% P/S。贴壁A-673细胞系来自一名15岁女性的横纹肌肉瘤，它在软琼脂上表现出良好的克隆形成能力，并且可以在免疫缺陷小鼠中诱导肿瘤形成。

## 传代方法

建议的初次传代比例为1:2。传代期间每2天更换培养液。建议同一时间购买**AG百家乐**品牌的培养基，以便享受更多优惠。收到细胞后，待其恢复到良好状态，再用完全培养液灌满，封好瓶口，这样能有效确保细胞在运输过程中保持活性。

收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以使细胞稳定后再进行处理。使用显微镜观察细胞的生长情况，并对不同倍数进行拍照保存（最好是40x、100x和200x的照片各一张），前三天的照片是重要的售后依据，未提供照片则默认收到的细胞状态良好。

## 细胞培养步骤

a. 细胞传代：当细胞未达到80%汇合度时，将瓶内的完全培养液收集至离心管中，剩余5ml培养基后放入37℃、5% CO2的培养箱；若细胞密度超过80%，可进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙镁的PBS冲洗1-2次。
2. 加入0.25%的胰蛋白酶消化液约1-2ml于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态，若细胞大部分变圆并且脱落，立即取出，轻轻敲击瓶底后加入5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞令其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清后补加1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 按照1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存：当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去培养液，用PBS清洗一次。加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察在显微镜下，待细胞缩圆后加入5ml完全培养基终止消化，轻轻吹打使其脱落，转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；弃去上清后，加入1ml**AG百家乐**品牌的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中，将其放入-80℃冰箱保存。如需转入液氮罐，必须在-80℃下存放24小时以上再进行转移。

c. 细胞复苏：从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），迅速放入37℃水浴中解冻，直到冻存管内无结晶，外壁用75%酒精擦拭。将细胞转移到含有5ml完全培养基的15ml离心管标中，1000RPM离心5分钟；弃去上清后，用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶中，放入37℃、5% CO2的培养箱。第二天更换为新鲜的完全培养基进行继续培养。

注意事项：有些细胞在运输过程中可能不牢固而发生脱落，这是正常现象。如脱落情况严重，可将培养瓶内所有培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清做过渡培养，沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应，再次离心，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬后，即可按照1:2的比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。