双荧光素酶报告基因系统是一种广泛应用于生物医疗研究中的技术，旨在探索基因表达调控、蛋白质相互作用及信号通路。这一技术于1990年首次问世，经过30多年的发展，已在生物医疗领域取得了显著的应用成果。1993年，首个荧光素酶专利获得批准，1996年推出了双荧光素酶报告基因检测系统，随后快速得到推广。

该系统通常利用两种不同来源的荧光素酶，目前以北美萤火虫（Photinus pyralis）和海洋腔肠动物海肾（Renilla reniformis）的荧光素酶应用最为广泛。北美萤火虫的荧光素酶基因可编码550个氨基酸，蛋白质分子量为62 kDa，具有无需后修饰即可直接检测的酶活性。海肾荧光素酶则是一种36 kDa的单亚基特异活性蛋白，能够在转录翻译后即表现出催化活性。利用这两种荧光素酶，可以检测感兴趣基因的转录调控。

实验原理

该实验利用荧光素酶与底物结合后发生的化学发光反应特性，将目标基因的转录调控元件克隆在荧光素酶基因的上下游，从而构建荧光素酶报告质粒。经细胞转染后，经过适当刺激或处理，裂解细胞并测定荧光素酶的活性，通过荧光值的高低评估不同刺激对目标调控元件的影响。

在实验中，使用海肾荧光素酶作为内参质粒，以排除不同组别间细胞生长状态、细胞数量和转染效率差异的影响，从而提高实验结果的可靠性。北美萤火虫的荧光素酶在ATP、Mg²+及O₂的共同参与下，能催化荧光素氧化，发出黄绿色光，波长范围在540~600nm；海肾荧光素酶则能在O₂的参与下催化腔肠素氧化，发出蓝色光，波长主要在460~540nm。

实验步骤

实验步骤包括以下几个关键环节：

1. 报告基因质粒构建：将目标片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体中。
2. 转染细胞：将报告基因质粒和内参质粒共同转染到细胞中，培养48小时。
3. 细胞处理：根据实验需求对细胞进行处理。
4. 裂解细胞：使用裂解液对细胞进行裂解。
5. 荧光值测定：加入底物荧光素，测定萤火虫和海肾荧光素酶的荧光值。
6. 数据处理：计算相对荧光素酶活性，并进行统计分析，以评估组间差异的显著性。

应用场景

双荧光素酶报告基因系统适用于多种生物医学研究，包括：

1. 研究miRNA与靶基因的相互作用，验证miRNA与mRNA、lncRNA、cirRNA的互作。
2. 探讨转录因子与启动子之间的互作，研究其对基因表达的调控作用。
3. 进行启动子活性分析，验证启动子的表达模式及强度。
4. 进行启动子SNP分析，分析基因启动子区域的单核苷酸多态性。
5. 研究细胞内信号通路的激活与传导，通过测量不同条件下的荧光素酶活性变化来评估信号通路的反应。
6. 用于药物筛选，评估药物对基因表达的影响。

常见问题及解决方案

在执行双荧光素酶实验时，可能会遇到一些问题：

• Q1：荧光值过高可能导致超出仪器检测范围。建议减少质粒的转染量，或裂解后离心取上清进行检测。
• Q2：实验结果不稳定或复孔间差异大，确保细胞状态一致，优化转染条件以及定期校准移液器以提高样本的一致性。
• Q3：相较于荧光蛋白，荧光素酶的灵敏度提高了10-100倍以上，并且在活体实验中具有更优异的荧光穿透性和低底信号。

在双荧光素酶报告基因系统的应用中，AG百家乐提供专业的支持和服务，帮助客户实现更高效的实验效果。如需了解更多服务内容与交付周期，请咨询我们的销售经理。