最近，许多同学向小尚反馈细胞复苏不理想。细胞复苏是细胞培养中的一项常规操作，但在过程中存在许多容易被忽视的细节。细胞的复苏成败与冻存及复苏操作密切相关，稍有不慎可能会造成无法挽回的损失。本文将从冻存的角度进行分析，并计划在下周更新复苏操作的原因排查，欢迎同学们收藏关注。

冻存步骤回顾

我们先来回顾一下细胞冻存的基本步骤：

1. 提前准备好冻存液备用。
2. 离心获得细胞沉淀后，加入冻存液轻轻重悬细胞。
3. 将细胞悬液转移至冻存管。
4. 如果使用程序冻存液，将冻存管放入程序冻存盒，然后置于-80℃冰箱过夜，之后转入液氮保存。如果使用非程序冻存液，则无需冻存盒。

冻存常见错误操作

以下是一些在冻存过程中常见的错误操作：

1. 未使用适当的降温措施

在使用常规含血清的冻存液（培养基+血清+DMSO）时，如果没有使用程序降温冻存盒或泡沫盒等保温措施，会导致细胞因降温过快而形成冰晶，从而损伤细胞。因此，使用常规冻存液时务必搭配冻存盒使用。目前市场上的程序冻存盒可以确保温度以1℃/min的速度缓慢下降。对于没有冻存盒的同学，可以将冻存管置于泡沫盒中，在4℃下静置5-10分钟，随后在-20℃静置2小时后转入-80℃冰箱过夜，第二天再转入液氮保存。如果没有冻存盒和泡沫盒，建议使用无血清的非程序冻存液，因其含有更多的保护剂，允许直接重悬细胞后置于-80℃冰箱过夜，之后转入液氮。

2. 冻存前细胞状态不佳或密度过低

确保细胞状态良好是成功复苏的基础，选择对数生长期且汇合度超过80%的细胞进行冻存。如果冻存前的细胞培养上清呈橘黄色，建议更换培养液并静置培养4小时再进行冻存。尽管冻存液含有保护剂，但在冷冻过程中依然会有少量细胞死亡，因此冻存密度不应太低，以200-300万/mL/管为宜。如不方便计数，可采用一个T25瓶冻存1-2管，一个10cm皿冻存2-3管（注意细胞必须达到80%以上的汇合度）。

3. 直接添加DMSO到细胞悬液

在未提前配制冻存液的情况下，直接将DMSO加入细胞悬液，可能对脆弱的细胞造成损伤。尽管一些细胞可能影响不大，但为了确保实验的顺利进行，建议先配制好冻存液再处理细胞。

4. 冻存液重悬细胞后直接放入液氮

将细胞悬液直接放入液氮的做法不可取。液氮的温度低达-196℃，未经梯度降温，细胞直接放入液氮将致使迅速死亡。因此，需确保经过-80℃冰箱的预冷步骤。

5. 冻存液配方不当

研究表明，5%-10%的DMSO是细胞冻存的最佳选择。具体比例应根据细胞种类进行调整，对DMSO敏感的细胞比例需降低。根据小尚的经验，8%DMSO适用于大多数细胞系。此外，还需根据细胞培养的难易程度调整血清的比例，难以培养的细胞应增加血清的使用，过于脆弱的细胞则可采用血清+DMSO的冻存法，而不需添加培养基。无论使用何种冻存液，建议进行冻检后再进行大规模冻存：在冻存24小时后复苏一支，确认细胞状态良好再进行批量冻存。同时，冻检成功前需保留至少一瓶细胞培养，以防复苏失败导致细胞绝种。

6. 冻存条件不当或冻存时间过长

通常，液氮储存的稳定性远好于-80℃冰箱。由于-80℃冰箱经常开关门，温度不稳定，细胞的活率会迅速下降，因此尽量选择液氮进行保存。对于没有液氮罐的同学，将冻存管放在-80℃冰箱的内部位置，定期检测复苏活性。

以上是关于细胞冻存的一些建议和注意事项。为了确保实验顺利进行，我们建议同学们遵循以上步骤，确保细胞的存活率。万一出现问题，请及时查找原因，确保下次操作无误。同时，欢迎关注[AG百家乐]，获取更多生物医疗领域的专业知识和实用技巧。